MICM整合诊断技术解析连载内容即将迎来基因分析专题，仍然由大家所熟悉的高博医学（血液病）北京研究中心北京高博博仁医院童春容主任为我们深入解读，因为内容丰富，我们将分上、中、下3期为大家呈现。血液肿瘤是一类由于造血干/祖或前体细胞染色体异常或基因变异，导致细胞增殖、分化或凋亡异常，恶性血液细胞大量增加的疾病。而基因异常主要包括以下类型：1、染色体异常导致的基因异常如染色体丢失或断裂导致该染色体上全部基因功能丢失；染色体断裂后与另一基因拼接形成一新的融合基因，产生基因功能异常等等。染色体异常可采用染色体核型分析及荧光标记探针的原位杂交技术（FISH）来检测。2、大片段基因丢失或重复等如急性B淋巴细胞白血病有IKZF基因大片段的缺失预后不好。可结合多重连接探针扩增技术（MLPA）和基因测序仪来检测分析。3、融合基因融合基因指原来的两个基因断裂，重新拼接形成融合基因。目前，很多以融合基因命名的独立急性白血病类型，如急性淋巴细胞白血病伴ETV6-RUNX1融合基因，它的预后好，化疗治愈率高达90%以上。过去，想要一次检测多种融合基因，临床上多采用多重巢氏PCR方法，这种方法只能检测已知的融合基因，而且如果设计的试剂与患者融合基因断裂点不相符就检测不出来，所以漏检率很高。目前已经采用二代测序方法（NGS）检测融合基因，几乎可以检测出检测范围内的融合基因。融合基因几乎只存在于肿瘤细胞上，初诊或复发时筛查出的融合基因可以作为肿瘤标志物，以后用实时定量PCR监测残留白血病，或者深度测序定量；敏感度可以达到10万分之一甚至百万分之一，也就是说，10万或百万个细胞中有一个白血病细胞都能检查出来。临床医生可以通过监测白血病融合基因来了解治疗效果、调整治疗方案。4、基因变异基因变异既往称基因突变。近年来，学术界统一将“基因突变”改为“基因变异”，因此，以下统一称为“基因变异”。基因变异是指一个人的基因上单个或者多个核苷酸序列改变，和正常人不一样，包括核苷酸缺失或插入、扩增、复制等。检测基因变异的方法主要有一代测序及NGS方法。一代测序法（Sanger 法）的测序长度可达600-1000bp, 是目前测序方法中读长最长的，但 Sanger 测序法的检测灵敏度有限，对于单个核苷酸点变异的检测灵敏度为10%~15%，也就是说，白血病细胞比例需要在10%以上才能用该方法测出。此外，一代测序法慢，很难一次检测大量的基因。NGS又称为高通量测序，具有高准确性、高通量、高灵敏度和低运行成本等突出优势，可以较快检测出几百种甚至全基因测序，对DNA和RNA序列进行分析。NGS一次筛查很多白血病基因可以发现一个患者携带的多种基因变异。同样是急性白血病类型，不同患者携带的基因变异种类及组合、频率可能很不一样，它们可以预测白血病的预后、指导靶向用药。治疗后可用10万层以上的深度测序定量这些变异基因，可以判断疗效，帮助指导调整治疗方案甚至治疗路线。由于NGS大量用于临床指导治疗，后面会较详细地分析。5、基因表达异常分析多种恶性肿瘤是由于原癌基因或转录基因激活所致，表现为原癌基因或转录基因定量明显升高，如WT1等。所以一些医院会通过这些原癌基因的定量来监测白血病治疗的疗效。6、基因调控分子异常基因表达（从基因到形成蛋白质的过程）会受很多调控分子的影响，如microRNA、表观基因的调控、组蛋白的修饰等；如果这些调控分子异常，也会导致最后基因编码的蛋白质及其功能的异常。7、基因拷贝数的变化一些患者的基因拷贝数明显异常或基因表达谱异常，与恶性肿瘤的发生发展也有关系。临床上可以采用基因芯片技术与检测来分析基因拷贝数的变化。目前血液肿瘤诊治临床应用的基因检测技术主要有以下几方面：融合基因检测染色体断裂，不同部位的两段基因融合在一起就形成了融合基因。一些重现性融合基因的检测具有决定性诊断及预后作用（见染色体节）; 而治疗后定期监测融合基因，是最敏感的监测微小残留肿瘤（MRD）的方法; 一些融合基因还有指导靶向药的作用。检测融合基因的方法主要包括：染色体、FISH、多重聚酶链反应（PCR）、基因测序方法；一次性筛查多种融合基因的方法主要有多重巢氏PCR及NGS。1.初治时的融合基因检查目前对于初治白血病，很多医院常常用染色体、FISH、PCR检查融合基因；但近年来，NGS逐渐广泛用于融合基因的筛查。当染色体发现有融合基因，可以再用FISH或PCR的方法验证。有时染色体断裂易位的片段很小，用普通染色体核型分析方法检测不出来，但是可以用FISH或PCR检测出相应的融合基因，称为隐匿性染色体易位，这些融合基因具有与该染色体易位相同的价值。因此初治时，很多医院用FISH检测世界卫生组织（WHO）分类中出现的融合基因；或者用多重巢氏PCR筛查常见的融合基因。但FISH、多重巢氏PCR只能检测已知的融合基因，FISH检测需要购买已知的荧光标记探针、多重巢氏PCR需要提前设计检测引物及探针。一旦患者的融合基因是未知的，就不能用以上方法检测到；或者断裂点不在检测的引物或者探针可检测范围，多重巢氏PCR就不能检测到。根据既往的统计，多重巢氏PCR检测急性白血病，只有40%-50%的患者检测到融合基因，而且绝大多数患者只能检测到一种融合基因。而NGS方法不需要检测试剂，可以检测目标基因上任何断裂点的融合基因，绝大多数患者可以检测到一个甚至多个融合基因，为疾病的诊断、预后判断、靶向药的准确、MRD的监测提供了很好的指标。2. 治疗后融合基因的监测融合基因是血液肿瘤，尤其是白血病非常特有的标记，治疗后定量监测可以反应白血病的疗效，提前预测可能的复发。目前最敏感的融合基因定量方法为荧光标记实时定量PCR（Q-PCR）。基因变异的检测每位血液肿瘤患者都存在基因变异。基因变异包括基因大片段丢失或扩增，碱基或片断的丢失、插入、重复或增加。基因大片段丢失或扩增（数百万碱基以上的片段变化）可用染色体核型分析或FISH检测；检测数百万碱基以下的片段变化可用基因芯片技术进行基因片段拷贝数变异（CNV）分析，又称为CNV芯片技术；但是对数百个碱基长度以下的片段变化，尤其是基因碱基点变异需要用基因测序技术。随着基因检测技术迅速用于临床及研究，我们发现血液肿瘤的基因变异具有重要的临床意义，从而更促进了基因检测技术的发展。2008 WHO造血与淋巴组织肿瘤分类开始将基因变异作为血液肿瘤的诊断及分类标准。基因测序是检测基因变异最常用方法，可以检测目的基因的全部变异类型，与既往的方法比较可以提高基因变异的检出率。如核仁磷酸蛋白基因1（NPM1）有40多种变异位点，既往的方法只能检测其中最常见的10种变异位点，而目前的二代测序方法可检测几乎NPM1的全部变异位点。有一些血液肿瘤，由于组织标本少，其它方法难以有足够标本诊断；或治疗获得完全缓解后来到我院，怀疑既往的诊断，这时基因测序就可以用骨髓/血涂片、组织切片、组织印片等少量标本来做几十种甚至全基因变异筛查。专家介绍 童春容高博医学（血液病）北京研究中心北京高博博仁医院高博医学（血液病）研究中心免疫与靶向治疗学科带头人，高博医学（血液病）北京研究中心北京高博博仁医院科研院长。血液一科（普通血液病）主任，从事血液内科临床工作及实验研究30多年。擅长各类恶性血液肿瘤的整合诊断（整合临床病史及多种实验室诊断技术）及综合诊疗（化疗、免疫治疗、靶向治疗、中药等），注重个性化精准诊疗，尤其擅长血液肿瘤的免疫治疗。为国内较早一批开展免疫治疗的专家之一，在CAR-T细胞治疗难治复发血液肿瘤领域为国际领先水平，获得国际学术界的认可。领导团队与企业合作联合在国内率先采用新型第二代CD19-41BB-CART CAR-T细胞治疗难治复发的急性B淋巴细胞白血病；此后联合开发了多种靶点的CART临床用于治疗血液肿瘤，包括CD1a、CD4、CD7、CD20、CD22、CD30、CD33、CD70、CD79b、CD123、CD138、CD371等。是国内外开展CART临床研究病例数及种类最多的中心治疗之一。多开发项研究成果在ASH、EHA、JSH上展示，多篇论文被《Leukemia》、《Blood Cancer Jour》等著名杂志收录。还注重发展多种免疫治疗技术，如新抗原免疫治疗等治疗血液肿瘤及实体瘤等。作者 | 童春容编辑 | 赵薇排版 | Cécilia
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